前言
结直肠癌是世界上最常见的癌症之一，死亡率位居第二。而炎症性肠病(IBD)被证实可能增加结直肠癌患病风险。目前的抗炎药物可以减少结肠炎相关结直肠癌的发展，但长期使用存在着危及生命的副作用。因此，我们需要探索治疗IBD和帮助预防炎症性结肠癌的更有效、更安全的天然药物。
作者在前期的研究中，将从健康婴儿的粪便中提取的一株加氏乳杆菌用于发酵含有柘树叶提取物的牛奶，得到一种合生元发酵乳，它在体外表现出高抗氧化活性和高免疫调节活性，这些结果提示着它可能具有潜在的缓解结直肠癌的作用，但是还未在体内得到验证，因此作者在偶氮甲烷（AOM）/右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的结肠相关直肠癌（CRC）小鼠模型中研究了合生元发酵乳与益生菌加氏乳杆菌（LG）和益生元柘树提取物（CT）对癌症保护作用，此外还对炎症、结肠屏障、细胞凋亡和癌细胞增殖相关的生物标志物进行了监测。
创新点
?从健康婴儿的粪便中分离出的一株具有益生特性的加氏乳杆菌，配合柘树叶提取物作为益生元制作得到一种新型合生元发酵乳?通过AOM/DSS诱导小鼠结肠癌模型证明合生元对于结肠癌的缓解作用?在mRNA水平和蛋白质水平两方面定量分析各种标志物水平实验设计及内容
8周龄的雄性C57BL/6小鼠分为五组，每组10只，分别为正常组，模型组，益生菌LG组，益生元CT组，合生元共生组合（FCT）组，正常组每天使用PBS灌胃，模型组使用AOM/DSS干预建模，LG组在模型组的基础上每天使用含有加氏乳杆菌的菌液灌胃，益生元组在模型组的基础上使用添加CT的发酵乳灌胃，合生元组在模型组的基础上使用合生元发酵乳灌胃。
经过十周的治疗期后，对小鼠实施安乐死，切除结肠，PBS冲洗并纵向切开，量化肿瘤，一半用10%中性缓冲福尔马林固定，并进行苏木精和伊红(HE)染色，另一半保存在液氮中，用于提取和实时PCR、酶联免疫吸附测定(ELISA)和Westernblot分析。
对结肠代表性区域切片进行组织病理学检查用于组织病理学分析，用ELISA分析细胞因子蛋白水平，Westernblot用于分析细胞膜蛋白，炎症相关酶，凋亡和肿瘤的相关标志物的蛋白水平，qRT-PCR用于它们的mRNA水平的分析，PacBio系统进行微生物群落分析，GC-MS用于短链脂肪酸（SCFA）分析。
结果分析
结肠的一般反应
与模型组相比，LG、CT和FCT对DSS干预后的体重减轻有明显的保护作用；从图中可以看出三个治疗组预防了DSS导致的结肠缩短，对肿瘤细胞的量化发现，所有模型组的小鼠都有结肠肿瘤，但三个治疗组都抑制了肿瘤的发展，FCT组对肿瘤细胞的抑制作用最高；对HE染色的结肠组织进行了组织学检查，结果显示正常组的上皮，间隙和黏膜下层完整，模型组小鼠出现明显的隐窝上皮扭曲和广泛的粘膜损伤，LG、CT、FCT组隐窝结构保存较好，组织学特征进一步改善。
AOM/DSS对小鼠肿瘤发展的影响以及LG、CT和FCT发酵CT对AOM/DSS诱导的CAC小鼠模型的恢复
(a)AOM/DSS诱导的CAC模型和样品(LG、CT或FCT)治疗的实验程序
(b)各组小鼠平均体重的变化
(c)第11周测量和比较各组结肠长度的照片
(d)第11周各组结肠平均长度图表
(e)各组结肠肿瘤的发生情况
(f)两组结肠代表性组织切片的HE染色(倍镜)
炎症调节
结肠炎症是CRC发生的重要原因，Th1和Th2的稳态是调节炎症的关键，促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α可以刺激初始CD4+T细胞向Th1细胞成熟，并抑制Th2成熟，由于这种相互作用，Th1和Th2的比值增加，促进炎症的发生，相反抗炎细胞因子IL-4促进Th2成熟，抑制Th1细胞增殖，减低Th1和Th2的比值，减轻炎症。图(a)是各种炎症因子mRNA水平的分析，从左到右依次是正常组，模型组，LG组，CT组和FCT组，可以看出模型组中促炎细胞因子的增加，抗炎细胞因子的减少，而三个治疗组中炎症反应的水平大大减少，尤其是FCT组促炎细胞因子mRNA表达被高度抑制，达到与正常组相似的水平，使用ELISA对特异性细胞因子的定量分析也支持这一结果。
诱导型一氧化氮合酶(iNOS)产生通过促进L-精氨酸产生一氧化氮而导致炎症，环氧合酶-2（COX-2）可以将花生四烯酸转化为前列腺素，前列腺素是疼痛炎症和发热的介质，抑制COX-2和iNOS的mRNA表达和蛋白产生是预防上皮细胞炎症的关键。在这项研究中,AOM/DSS诱导了iNOS和COX-2的mRNA表达和蛋白生成，但LG/CT/FCT逐渐抑制了AOM/DSS诱导的CAC小鼠的mRNA表达和蛋白生成，这表明LG、CT和FCT可以通过抑制iNOS和COX-2减少结肠炎症。
AOM/DSS和LG、CT、FCT对小鼠结肠免疫应答的影响
(a)RT-PCR对凋亡标记物进行mRNA定量
(b)Westernblot检测凋亡标记物的蛋白生成
(c)Westernblot检测肿瘤细胞增殖相关标志物的蛋白生成??
(d)Westernblot法测定iNOS和COX-2的蛋白生成
结肠屏障的恢复作用
肠道屏障由黏液层和一层排列紧密的肠上皮细胞组成，肠道屏障功能障碍是多种疾病的原因，上皮细胞间的紧密连接蛋白occludin、ZO-1和黏液层的低聚粘液凝胶形成蛋白（MUC-2）和以及粘液相关三叶肽因子TFF-3与结肠屏障密切相关，而且肠道屏障功能障碍可由促炎细胞因子TNF-α和IL-1调控，它们是肠道屏障功能障碍的治疗靶点，在此研究中上一部分已经提到合生元发酵乳可以抑制这种促炎细胞因子的产生，在这一部分对紧密连接蛋白及黏液层相关蛋白的mRNA和蛋白水平的分析进一步说明FCT可以通过恢复粘液层和紧密连接来克服肠道屏障损失，缓解炎症。
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LG、CT和FCT对AOM/DSS诱导CAC小鼠结肠黏液(MUC2和TFF3)和结肠屏障相关蛋白(occludin和ZO-1)的恢复
(a)利用RT-PCR对MUC2、TFF3、occludin和ZO-1mRNA进行定量
(b)Westernblot法测定蛋白产量，并与β-actin产量进行标准化比较??
增强细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖
细胞凋亡是由细胞变化引起的程序性细胞死亡事件，肿瘤细胞会抑制细胞凋亡从而无节制的增殖，因此凋亡是抑制肿瘤细胞的重要过程。在此研究中AOM/DSS明显抑制促凋亡相关标志物p53、p21、Bax水平，但增加了Bcl-2和Bcl-xL（通过抗凋亡作用促进细胞存活）的产生，表明其抑制了细胞凋亡，增强了细胞增殖，治疗组显示了相反的结果，表明LG,CT,FCT可以降低AOM/DSS对小鼠肠道的致癌作用。
NF-κB调节与细胞增殖相关特定基因的转录，而IKB-α可以抑制NF-κB转录因子特异性DNA结合活性，在Wnt通路中，Wnt信号通过酪蛋白激酶1(CK1)和糖原合酶激酶3(GSK3β)启动β-catenin磷酸化，刺激它在细胞质中的积累，积累的β-catenin被转移到细胞核中，促进癌症蛋白相关基因的转录，因此抑制β-catenin和NF-κB，促进IκB-α可以抑制癌症细胞增殖，这部分的结果也表明，FCT具有这样的效果。
LG、CT、和FCT对AOM/DSS诱导CAC小鼠结肠组织的促凋亡、抗凋亡标记物和肿瘤细胞增殖标记物的检测
(a)使用实时RT-PCR对凋亡标记物进行mRNA定量
(b)Westernblot检测凋亡标记物的蛋白生成
(c)Westernblot检测肿瘤细胞增殖标志物的蛋白生成
微生物群落的变化
从第1、6和11周收集粪便样本，并将收集的样本用于肠道微生物群组成的宏基因组分析。第1周第一次收集粪便样本时，未做过任何处理。宏基因组分析显示，第1周各组肠道菌群组成相似。第6周后的宏基因组分析显示，各组肠道菌群组成与第1周有较大差异，模型组的葡萄球菌数明显增多，16srRNA全序列分析显示，该葡萄球菌的主要菌种为朗氏葡萄球菌和肖氏葡萄球菌，可能与炎症性疾病有关。但是LG、CT和FCT的处理逐渐减少了葡萄球菌的成分，提示它们可能在第6周减轻肠道炎症。另外，LG、CT、FCT处理均增加了乳酸菌、Akkermansia、双歧杆菌的组成。随后对LG组、CT组和FCT组的16SrRNA全序列分析显示，该乳酸菌的主要菌种为加氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠乳杆菌，可能与抗炎有关。
第11周LG组和FCT组葡萄球菌成分明显低于第6周，而CT组的葡萄球菌成分没有显著变化，说明葡萄球菌的抑制作用可能主要来源与加氏乳杆菌的作用有关。
AOM/DSS干预和LG、CT和FCT对小鼠肠道菌群组成的影响(a)第1、6、11周各组小鼠肠道菌群的组成分析(b)第1、6、11周小鼠肠道代表性益生菌分析(c)第1、6、11周各组的主坐标分析(PCoA)图
短链脂肪酸的调节
SCFA是由肠道菌群特别是乳酸菌和双歧杆菌产生的，在维持肠道菌群健康和预防肠道疾病方面发挥着重要作用。上一部分的研究显示LG/CT/FCT增加了产生SCFA细菌的数量。为了验证这一点，作者对小鼠粪便的SCFA做了分析，结果如图，可以看出治疗组中乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐的数量大大增多，FCT是最能刺激特异性肠道细菌生长和产生SCFA。因此，FCT可能在抑制炎症相关细菌方面发挥重要作用。
第1、6、11周，用GC-MS测定收集粪便样品中的SCFAs、乙酸、丙酸和丁酸酯
讨论
根据益生菌和/或益生元可能对调节肠道菌群有效这一建议，本研究选择了具有抗氧化活性的LG作为益生菌新菌株，选用了CT作为天然益生元。乳汁发酵过程中LG和CT对pH有降低作用，CT对LG有特异性生长刺激作用。特别地，该发酵牛奶与FCT显示出β-酪蛋白生物活性肽和壳聚糖酚类化合物的抗氧化活性。
本研究表明，FCT的干预可以降低AOM/DSS诱导的肠道损伤小鼠的炎症和癌变，甚至可以恢复肠道菌群的生态失调。FCT通过调节几种结肠癌相关信号标志物和肠道微生物群在CRC中具有抗癌作用，可能是一种天然的抗炎症性结肠肿瘤发生的预防剂。
AOM/DSS和FCT干预小鼠模型结果表明，AOM/DSS诱导的CAC小鼠给予FCT对减轻炎症反应、恢复结肠屏障、增强肿瘤细胞凋亡具有调节作用，表明其具有抗肿瘤作用
论文信息
原名:Cancer-protectiveeffectofasynbiotic