新辅助放化疗联合阿特珠单抗治疗可切除的食管腺癌：单臂II期可行性研究（PERFECT）
杨从容
王军
医院放疗科
西方国家食管腺癌（EAC）发生率呈上升趋势。对于可切除的EAC（rEAC），CROSS方案（卡铂+紫杉醇+同步放疗）的新辅助化放疗与单独手术相比可提高患者生存率。然而近一半的患者在5年内仍会经历疾病进展和死亡。
免疫性检查点抑制（ICI）在几种实体瘤中的成功可能会改善rEAC的预后。除PD-L1表达外，似乎还有其他一些因素决定了转移性胃食管癌（GEC）对ICI的反应，包括肿瘤免疫微环境，肿瘤突变负荷（微卫星不稳定性）和微生物组成。生物标志物识别可能是受益于ICI的患者以及挽救那些未受益于ICI的潜在（自身免疫相关）毒性的患者的关键。
本文探索了新辅助放化疗联合抗PD-L1阻断剂（阿特利珠单抗）治疗rEAC的可行性和有效性。转化医学终点包括基于RNA测序和肿瘤活检的免疫组织化学（IHC）的潜在生物标志物的发现。
≥18岁，经病理证实为rEAC（cT4b，cN0或cN+，cM0），如果大部分肿瘤位于食管远端或胃-食管交界处、胃-食管交界处，则符合条件。在开始治疗前所有患者均经过胃镜和内镜超声（EUS）、PET-CT和颈部超声进行分期。在治疗的第3周患者接受第二次胃镜检查用于转化医学研究。患者按照CROSS方案接受常规nCRT，在nCRT的第1周和第4周静脉输注阿特利珠单抗（mg），nCRT后的第7、10和13周进行阿特利珠单药治疗。分期后符合条件的患者在14-16周接受手术。外科手术包括微创经胸食管切除术和两野淋巴结清扫术，以及进行胸腔内或颈部吻合术的胃管重建术。
主要研究终点是可行性，定义为使用阿特利珠单抗的治疗完成率。次要终点包括毒性、nCRT完成率、停药或延迟手术、术后并发症（Clavien-Dindo分类）、病理反应（Mandard分级[TRG]）、R0切除率、无进展生存期（PFS）和总体生存期。探索性终点是基于可预测的生物标志物的开发。
为了比较PERFECT试验与CROSS试验的常规nCRT结果，从荷兰癌症登记处（NCR）选择了-年期间诊断并在高容量中心接受治疗的rEAC患者队列（每年≥40例经CROSS方案治疗）进行倾向性评分匹配。
将基线、治疗中的活检和切除标本保存在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）块中。为了评估肿瘤免疫微环境的作用，对T淋巴细胞（CD3）、调节性T细胞（Tregs，FOXP3）、程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）用22C3抗体进行了单参数IHC染色和PD-L1的CPS评分。对肿瘤上皮细胞（全细胞角蛋白）和CD8进行了双重染色。
如果病理学家怀疑反应不佳，则在基线、治疗中和切除标本中收集速冻活检。样品在IlluminaHiSeq上测序。基于前期研究，队列中针对六个基因IFNγ标记物（IDO1、CXCL10、CXCL9、HLA-DRA、STAT1、IFNG）进行了基线检测。在进行治疗时排除了1例患者，因为在治疗的第4周而不是第3周进行的活检。
从年7月到年3月，40例患者基线特征列于表1。
40例患者中有34例完成了阿特利珠单抗治疗的所有周期（85％）。未完成所有周期治疗的原因包括自身免疫相关毒性（n=3）、进展（n=2）和死亡（n=1）。37例患者（93％）完成所有化疗周期。3例患者由于血小板减少症（n=1）、住院（n=1）和过敏反应（n=1）减少化疗1周期。
总体毒性
任何级别最常见的与治疗相关的AE是疲劳（95％）、粘膜炎（60％）、恶心（53％）和厌食（43％；表2）。16例患者（40％）经历了3-4级AE。最多常见的是厌食（10％）、恶心（8％）和晕厥（8％）。前述不良事件主要发生在结合ICI的nCRT期间。在1名因肺栓塞死亡的患者中观察到5级AE。
在13例患者中观察到严重的AE导致住院或死亡（33％）。住院的原因如下：过敏反应（n=2）、发烧和斑丘疹（n=2）、进展（n=2）、发热性中性粒细胞减少症（n=1）、疑似败血症（n=1）、发热和低血压（n=1）、肺炎（n=1）、房颤（n=1）和头部外伤（n=1）。
自身免疫毒性
总共有6例患者（15％）经历了免疫相关的不良事件（irAE）。其中有2例患者为III级皮疹，2例患者为II级结肠炎/肠炎，2例患者II级甲状腺炎。所有患者均康复，无严重后遗症。除了1例III级皮疹事件发生在nCRT结合ICI治疗之后，irAE多发生在ICI单药治疗期间或之后。
手术
40例患者中有33例（83％）接受了手术。未进行手术的原因是疾病进展（n=4），患者选择（n=2）和因肺栓塞导致的死亡（n=1）。2例患者在阿特利珠单药治疗期间出现了疾病进展，另2例在反应评估中出现疾病进展。2例患者在交待手术相关事宜的过程中决定不接受手术。没有因发生与治疗有关的不良事件导致手术延迟，并且在手术后30或90天内没有死亡病例。最常见的手术并发症是肺（30％）、心脏（21％）或吻合口瘘（21％；表3）。
反应与生存
R0切除率为％（n=33）。30％（10/33）的患者达到病理完全缓解（pCR;ypT0N0）。根据Mandard标准得出的TRG评分为：TRG1（ypT0；n=11；33％），TRG2（n=4；12％），TRG3（n=9；27％），TRG4（n=8；24％）和TRG5（n=1；3％）。在这33例患者中，1名患者最初表现为术前进展（经组织学证实，腹壁转移），但是后续的PET-CT显示该病变已消除。因此该患者进行了手术，切除标本显示完全病理缓解。
在PERFECT试验中，总共比较了荷兰癌症登记处例患者和本组40例患者。在R0切除或病理反应率方面，队列间未观察到统计学差异：R0（PERFECT82.5％[n=33/40]vs.nCRT85.8％[n=/];χ2p=0.61）；pCR（PERFECT25％[n=10/40]vs.nCRT20.1％[n=27/];χ2p=0.51）或TRG1-2（PERFECT37.5％[n=15/40]vs.nCRT43.3％[n=58/];χ2p=0.52）。
PERFECT试验OS为29.7个月，nCRT队列中为34.3个月，HR=0.78（95％CI0.42至1.45，p=0.；图1A）。PFS为19.4个月vs.22.7个月，HR=0.96（95％CI0.59至1.58，p=0.；图1B）。探索性分析比较了两个队列中反应者（TRG1-2）和非反应者（TRG3-5，术前进展或未手术）的OS/PFS。PERFECT试验的反应者两年OS为92％，而nCRT反应者为76％，HR=0.27（95％CI0.04至2.03；对数秩p=0.；图1C）。两个队列反应者的PFS为85％vs.65％，HR=0.37（95％CI0.09至1.58；对数排名p=0.；图1D）。
探索性转化分析
反应者和非反应者之间PD-L1表达（CPS）的临界值分别取值为1、10或25，结果显示PD-L1表达在基线水平没有统计学差异，尽管与无反应者相比，反应者CPS高于预设临界值的比例更高。CPS≥25时产生了最大的OS差异HR=0.45（95％CI0.10-2.09;p=0.;图2A）和PFS差异HR=0.37（95％CI0.12-1.11;p=0.;图2B）。治疗中的IHC标记的FOXP3表达在无反应者中比在反应者中更高，这表明无反应者的Treg数量更高。IHC标记的CD3，CD8，PD-1在基线和治疗中均未显示出反应者和非反应者之间的明显区别。
在基线活检中，我们检查了先前建立的六基因IFNγ标志物，与无反应者（n=20；p=0.；图2C）相比，在反应者（n=12）中显示出更高的表达得分。但是在多因素logistic回归分析中，标志物没有达到预测反应的统计学意义（p=0.）。
RNA测序探索了治疗中活检组织的共抑制性检查点（例如TIM-3，LAG3）和对PD-L1阻断的潜在耐药机制（例如IDO1，ARG1）。找到了一组先前与ICI抗性相关的14个基因，这些基因在反应者中低表达，在非反应者中显示出两个不同的组（图3A）。第一组14个基因高表达（炎症检查点高表达；Z分数0；图3A）。第二组14个基因低表达（非炎症Z评分0；图3A），并且通过在基线和治疗中相应的活检组织中进行免疫去卷积测定发现细胞毒性淋巴细胞（CTL）减少（p0.05；补充图4）。在无反应者中，CTL含量与基因组Z评分之间存在正相关关系（图3B）。这意味着具有大量CTL的患者会高表达ICI耐药相关基因。两组无反应者之间的OS或PFS差异均无统计学意义（p0.05）。
由于只有少数无反应者切除标本具有足够的肿瘤用于RNA测序（n=8），我们评估了是否还可以根据治疗完成后的中位CD8IHC密度确定两个分组。实际上在无反应者中，我们在切除标本中观察到了CD8高组（CD8密度中位数）和CD8低组（CD8密度中位数）。与CD8低组相比，CD8高组同时显示出更高的CD3，FOXP3和PD-1密度（p0.05；图3C）。
这是首次将阿特利珠单抗（PD-L1抑制剂）与基于CROSS的nCRT结合用于rEAC。事实证明该治疗方案是可行的，有85％的研究人群接受了所有计划周期的阿特利珠单抗治疗。
除与PD-L1抑制剂相关的其他自身免疫相关毒性外，PERFECT试验中与新辅助治疗相关的AE和术后并发症与CROSS试验中报道的相当。总共有6例患者经历了irAEs，可以通过药物治疗并且不延迟手术。我们研究中的irAE与最近进行的一项II期试验相似，该试验研究了阿特利珠单抗联合白蛋白结合型-紫杉醇/卡铂新辅助治疗NSCLC（甲状腺功能减退症10％；皮疹17％；腹泻33％）。然而与我们的研究相反，该研究没有3-4级皮疹或过敏反应的报道。
在PERFECT试验中，pCR率高于CROSS试验（pCR分别为30％和23％）。然而与CROSS试验（7.9％）相比，观察到了更多的术前/术中进展的患者（12.5％）。后一项研究中基于PET-CT的反应评估不是强制性的，这可能导致对进展的估计不足。在我们的倾向性匹配人群中，使用CROSS治疗的患者病理反应率与PERFECT试验相似（p0.05）。综合这些结果，在rEAC中将阿特利珠单抗联合到基于nCRT的CROSS研究中似乎未增加治疗的有效性。这与最近在NSCLC中进行的一项研究形成鲜明对比，在NSCLC中所有接受切除的患者中有33％的新辅助阿特利珠单抗联合化疗后达到pCR，而以前的新辅助化学研究只有5-8％的pCR。我们的倾向性匹配队列和PERFECT试验之间的PFS和OS也相似。这与两项关于转移性胃食管癌（GEC）的阿维鲁单抗（PD-L1抑制剂）研究一致，与一线维持或三线化疗相比，未能显示生存率的改善。用于转移性GEC的其他免疫检查点抑制剂，如纳武单抗或帕博利珠单抗仅显示出较弱的生存改善，这在CPS≥5或≥10人群中最为明显。在辅助治疗中，对nCRT未达到pCR的患者（即有残留病变的患者）在应用纳武单抗进行免疫检查点抑制剂（ICI）辅助治疗后，无病生存率显著提高，但必须延长治疗时间（CheckMate-）。我们的探索性分析显示，与非ICI的治疗相比，基于ICI的短期新辅助治疗的有反应者可以从OS和PFS方面获得长期获益。在PERFECT试验的有反应者中，ICI诱导的免疫监视增强可能使得全身性疾病控制得到改善，从而排除了对ICI进行长期治疗的需要。这种探索性还需要使用随机对照组进行前瞻性验证。
基线时，在PERFECT试验中观察到有反应者的IFNγ得分高于无反应者，具有统计学意义。T细胞释放IFNγ可以导致肿瘤微环境中PD-L1的上调。实际上大多数缓解者包括基线时CPS评分≥1、≥10或≥25的患者。必须注意的是与最近对主要转移性胃食管腺癌患者进行的CPS评分（CPS≥10（15％））回顾性分析相比，我们研究中基线CPS≥10（43.6％）或≥25（38.5％）的患者百分比相对较高。最有可能的是在我们的研究中，疾病阶段（局部晚期）和样本量较小可能影响了CPS评分，因为试验人群未筛选基线时的PD-L1状态。总之，在新辅助治疗中应进一步探索IFNγ标志物和PD-L1的表达（CPS）作为潜在的生物标志物预测对新辅助ICI治疗的有效性。
在治疗中的活检标本，我们发现了在基线组织中表达不明显的两个无反应亚组，说明了治疗中活检的附加价值。第一亚组患者的特征为具有大量细胞毒性淋巴细胞（CTL）并且其与T细胞衰竭相关的基因（例如PDCD1，HAVCR2，LAG3；编码PD-1，TIM-3和LAG-3的基因）高表达。最近在单细胞RNA测序研究中，在用检查点抑制剂治疗的黑素瘤患者中也观察到了无反应者治疗中衰竭T细胞的存在。为了改善治疗反应，该组患者可从其他缓解T细胞衰竭的检查点阻滞中获益，例如TIM-3或LAG-3抗体。第二组无反应者的特征是与ICI抗性相关的基因低表达，同时伴随低数量的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。对于这些患者，需要新的基于免疫疗法的策略。
位于结合部的rEAC另一种治疗选择是围手术期FLOT方案。目前正在进行的一些临床试验正在研究将ICI添加到FLOT方案中。一个重要的问题将是哪种方案可以实现与免疫疗法的协同作用，CROSS还是FOLT。在PERFECT试验中，在基线时具有高IFN-γ标志物评分的患者中大多数治疗有效。这表明nCRT+ICI主要对存在炎症微环境的患者有益，并且当前方案无法充分重塑免疫状况。FLOT方案的免疫原性将在ICONIC试验（FLOT+阿维鲁单抗）中通过对肿瘤免疫浸润的治疗中分析进行分析。肿瘤免疫微环境的全面表征对于鉴定有效性和评估rEAC患者新辅助化疗（放射治疗）与ICI之间的潜在协同作用至关重要。根据我们的研究，肿瘤微环境存在炎症（IFN-γ表达评分高）的患者可以从新辅助PD-（L）1抑制剂中受益。考虑到这些结果和CheckMate-的结果，在下一个研究中我们打算进行一项随机化的II期试验用以评估与标准nCRT相比，原发肿瘤IFN-γ表达评分高的患者新辅助纳武单抗结合化放疗的效果；两组中有肿瘤残存的患者再接受纳武单抗辅助治疗。
总之，rEAC患者在常规的nCRT中联合阿特利珠单抗是可行的，而不会影响手术效果。其他自身免疫相关毒性是可以控制的。与通过nCRT病理反应治疗的倾向性匹配人群相比，OS和PFS相似，尽管PERFECT试验中的反应者与nCRT反应者相比OS和PFS在数值上更长。此外，IFNγ标志物的表达与有效性相关。未来在rEAC新辅助治疗中加入免疫治疗的研究重点在于抵抗T细胞衰竭和增加肿瘤微环境中效应T细胞的丰度。
ClinCancerRes.Jan27;clincanres...doi:10.8/-2.CCR-20-.Onlineaheadofprint.
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