年5月4日，著名科学期刊《Nature》上发表了一篇题为：“间歇性抑制PI3Kδ可维持抗肿瘤免疫并抑制irAEs”的文章。文章第一作者Simon来自美国加州美国拉霍亚免疫学研究所。
磷脂酰肌醇-3激酶δ(PI3Kδ)在淋巴细胞中起关键作用，靶向PI3K的抑制剂已被批准用于治疗B细胞恶性肿瘤。实体瘤小鼠模型的研究表明，PI3Kδ抑制剂(PI3Kδi)可以诱导抗肿瘤免疫。临床研究发现(EudraCTno.--20)PI3KδiAMG在人类头颈部癌症患者中，能降低了肿瘤浸润调节性T(Treg)细胞的数量并增强了肿瘤浸润性T细胞的细胞毒性潜力。但是在AMG的试验剂量下，发生明显的免疫相关不良事件(irAEs)。小鼠模型的研究表面，PI3Kδi降低了Treg细胞的数量并引起结肠炎。为了明确这类副作用的免疫机制并指定对策，作者应用单细胞RNA测序分析等方法发现，PI3Kδi驱动的组织残留结肠ST2Treg细胞丢失，伴有致病性辅助T17细胞(TH17)和17型CD8T(T+C17)细胞的扩增，这可能是irAEs毒性的原因。进一步在小鼠模型中，改良的PI3Kδi的间歇性给药治疗方案既保留了抑制肿瘤生长作用，又不诱导结肠组织中的致病性T细胞而限制毒性。
PI3K抑制剂主要靶向癌细胞固有的PI3K活性，尤其是B细胞恶性肿瘤。后来发现，PI3Kδ抑制剂也有明显的T细胞介导的免疫调节活性(PI3Kδi优先抑制Treg细胞)，并导致irAEs而阻碍了临床进展和效用。本文作者深入研究了PI3Kδi对实体瘤患者免疫细胞的影响，并探讨了引发irAEs的机制及对策。
PI3Kδi引起irAEs
为了评估PI3Kδi作为人体实体癌免疫治疗药物的潜力，作者在一项新辅助，双盲，安慰剂对照随机II期试验中，将PI3KδiAMG用于治疗未接受治疗的可切除头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)患者(详细数据图1a，b)。作者测量了靶标抑制(使用B细胞中的磷酸化AKT(pAKT)水平)(详细数据图1c)和药物水平(详细数据图1d)以验证给药。33名患者按2:1的比例随机分配(AMG：安慰剂)参加试验，30名患者接受了至少一剂AMG或安慰剂。15名患者每天接受mgAMG治疗(每名患者7-24天)。出乎意料的是，在mg剂量下，15名患者中有9名因irAEs退出治疗。经过正式的安全性审查后，招募了另外6名患者，并以每天mg的减少剂量进行治疗。同样，6名患者中有3名患者出现irAEs，导致停止治疗。1名患者在完成24次每日剂量的AMG后出现4级结肠炎，最终需要结肠切除术(图1a)。最常见的irAEs是皮疹(29%；治疗组25%，安慰剂组4%)、腹泻(29%；治疗组28%，安慰剂组1%)和转氨酶升高(治疗组均为14%)，与治疗介导的Treg细胞或多种组织中Treg细胞功能缺失引起的免疫病理学一致。irAEs的发病速度惊人(中位发病时间为9天)，导致21名AMG治疗患者有12名停止治疗。在可评估的23名短暂治疗患者的研究组中，发现测量的肿瘤体积没有显著差异，其中有2名患者出现部分缓解，1名患者出现完全病理缓解（详细数据图1c），但他们也都出现3/4级irAEs。
图1：PI3Kδi驱动抗肿瘤免疫，但引起显著的irAEs。
a，PI3Kδi治疗(上)和安慰剂治疗(下)患者的治疗方案、间隔时间、irAEs的发生和等级；部分缓解或完全病理缓解的患者以洋红色突出显示。垂直虚线表示平均治疗时间。b，d，AMG-治疗和安慰剂治疗的患者的全肿瘤RNA-seq分析的火山图(b)或纯化的肿瘤浸润CD8+T细胞的批量RNA-seq分析(d)。治疗前和治疗后样品之间的DEGs以红色突出显示，并称之为DEseq2。c，安慰剂或AMG治疗患者治疗前和治疗后样品中FOXP3+细胞的中位细胞计数。AE，不良事件；NS，不重要。
PI3Kδi改变肿瘤微环境
对治疗前后肿瘤样本进行全肿瘤RNA测序(RNA-seq)分析显示，AMG治疗组存在显著差异(93个差异表达基因(DEGs))，但安慰剂组没有差异(3个DEGs)(图1b)。抑制PI3Kδ导致肿瘤样品中FOXP3转录水平显著降低(图1b)，免疫组化法证实肿瘤组织Treg细胞显著减少(PI3Kδi短间隔)(图1c)，但是一旦停止治疗，Treg细胞水平迅速恢复正常。
对经过筛选的肿瘤浸润的CD8+T细胞的RNA-seq分析显示，治疗后IFNG、GZMB和PRF1的表达更高，表明PI3Kδi治疗后肿瘤浸润CD8+T细胞的细胞毒性作用增强(图1d)。作者通过单细胞RNA-seq(scRNA-seq)分析证实了这些结果，该分析表明CD4+和CD8+T细胞簇表现出与治疗相关的细胞毒性基因表达的增加(例如，GZMB和PRF1)(详细数据图2a，b)。作者还发现，治疗后CD4+和CD8+T细胞有适度的克隆扩增(详细数据图2c)。由于组织CD4+FOXP3+T细胞数量较低(每位患者0-27个细胞)难以进行更详细的分析。但是抑制PI3Kδ导致活化的循环Treg细胞显著增加，而安慰剂组Treg细胞的比例和活化状态保持稳定(详细数据图2d，e)。这意味着PI3Kδ抑制可能通过改变组织归巢因子(如KLF2和S1PR1)的表达而影响增殖，或者取代组织中活化的Treg细胞(FOXO1的直接靶点与先前的研究一致)，而导致毒性。这些数据表明PI3Kδ抑制引起肿瘤微环境(TME)的深刻变化，其特征是CD4+和CD8+T细胞活化增强，寡克隆T细胞扩增和细胞溶解活性增加，与肿瘤内Treg细胞的减少一致，使T细胞活化并导致剂量限制性毒性的快速发作。
PI3Kδi对Treg细胞的系统性作用
为了解PI3Kδi诱导的毒性和抗肿瘤免疫应答的机制，作者在小鼠B16F10-OVA黑色素瘤实体瘤模型中测试了PI3Kδ抑制剂的作用。作者发现肿瘤体积显著减少(详细数据图3a)且肿瘤内CD8+T细胞数量显著增加，这些细胞表达高水平的PD-1并表现出增加的增殖能力和细胞毒性(详细数据图3b-e)。TOX是一种转录因子，最近被确定为对TME中CD8+T细胞的适应和生存至关重要，在PI3Kδi治疗后也增加了(详细数据图3f)。作者还发现颗粒酶B和Ki67的表达几乎只局限于TOX+CD8+T细胞(详细数据图3g)，这表明尽管这些细胞高表达PD-1和TOX，但在该肿瘤模型中功能并未缺失。
尽管最初认为PI3K抑制剂主要靶向癌细胞内在的PI3K活性，但是作者在Rag1/和Cd8/小鼠中观察到的抗肿瘤作用依赖于免疫细胞，更具体地说，依赖于CD8+T细胞(详细数据图4h)。由于PI3Kδ抑制在非肿瘤器官中引起大量的irAEs(图1b)，而Treg细胞与之有关，作者接下来评估了PI3Kδi是在肿瘤组织中的局部作用还是全身作用。值得注意的是，与安慰剂相比，PI3Kδi治疗小鼠的肿瘤、脾脏和结肠中Treg细胞显著减少，表明PI3Kδi对Treg细胞的维持或生存的系统性影响(详细数据图3i-k)。
PI3Kδi影响特异性Treg细胞亚群
由于胃肠道毒性是接受PI3Kδi治疗患者的主要irAEs之一（图1b），作者假设结肠组织中的Treg细胞可能对PI3Kδi特别敏感。为此，作者对从PI3Kδi和安慰剂治疗的B16F10-OVA肿瘤小鼠的肿瘤、脾脏（淋巴器官）和结肠组织中分离的Treg细胞进行了scRNA-seq检测。
UMAP分析确定了10个Treg细胞簇，意味着大量Treg细胞异质性和组织依赖适应性(图2a，b)；不同的Treg细胞亚型存在于不同的位置(详细数据图4a，b)，与之前的研究一致。在PI3Kδi和安慰剂治疗之间，结肠Treg细胞表现出最显著的差异，为DEGs，而脾脏和肿瘤Treg细胞差异出较少(详细数据图4c-e)。结肠Treg细胞的两个亚群(簇2和8)在PI3Kδi治疗的小鼠中缺失(图2a，b，详细数据图4f)。簇2结肠Treg细胞富含Ctla4和编码趋化因子受体的基因表达(Ccr1，Ccr2和Ccr4)，这对于它们的抑制和迁徙能力至关重要(详细数据图4g)。在对照治疗的小鼠中簇8结肠Treg细胞(类似于最近描述的组织滞留ST2Treg细胞)有显著的克隆扩增，但在PI3Kδi治疗的小鼠中缺失，这对于预防慢性炎症和促进组织修复至关重要(图2a，b)。作者发现ST2Treg细胞特征基因Il1rl1(编码IL1RL1(也称为IL-33R或ST2))、Gata3和Id2以及与Treg细胞高度抑制效应T相关的几个基因(Klrg1，Cd44，Cd69，Pdcd1，Areg，Nr4a1，Il10和Tgfb1)的表达丰富(详细数据图5a)。在蛋白质水平上验证了ST2在Treg细胞上的表达，并发现PI3Kδ抑制导致CD8+T细胞与ST2Treg细胞的比例显著增加(详细数据图5b)。而簇0和簇8中的结肠Treg细胞共享了该ST2特征(图2c)，只有簇8中的细胞表现出免疫抑制细胞因子IL-10的高转录表达(图2d)。PI3Kδi治疗的小鼠中具有高抑制特性的Treg细胞簇(2和8)缺失，而Treg细胞簇5抑制相关的转录缺失(图2e，详细数据图5c)，却高表达多个干扰素相关应答基因(Stat1，Stat3和Ifrd1)，提示存在促炎环境(详细数据图5a)。因此，在PI3Kδi治疗的小鼠中，ST2+Il10+Treg细胞显著减少(图2e)。值得注意的是，RNA速度分析是一种评估scRNA-seq数据中细胞发育阶段的工具，结果推断出在安慰剂治疗的小鼠中，在几个祖细胞状态(簇2，4和0)的发育轨迹，最终导形成克隆扩展的ST2Treg细胞(簇8)(图2f)。这些数据表明，PI3Kδ抑制可防止细胞分化为ST2Treg细胞，而将发育转移到缺乏与抑制能力相关的转录本表达的簇5Treg细胞，这可能是炎症和结肠炎发作的机制。作者还观察到结肠组织而非脾组织中CD8+T细胞显著增加(详细数据图5d，e)。结肠CD8+T细胞在PI3Kδ抑制下表达了更高水平的PD-1和ICOS(详细数据图5f，g)，这意味着与治疗相关的细胞活化变化。总之，这些发现表明某些结肠Treg细胞亚群对PI3Kδi的敏感性升高，可能与PI3Kδi治疗患者中观察到的结肠炎高发病率有关。
图2：PI3Kδi影响不同的Treg细胞亚型
图2a，b，统一流形近似与投影(UMAP)绘制了安慰剂治疗的对照小鼠中FOXP3+CD4+T细胞的单细胞转录组和T细胞受体(TCR)序列数据(a)和PI-治疗的小鼠(b)。圆的大小表示克隆扩张的程度。c，d，图示a，b指示簇中突出显示的基因的源码解析-标准化表达水平(色标描绘了表达细胞的百分比)。e，散点图显示在安慰剂治疗和PI-治疗的小鼠结肠Treg细胞中，突出显示的基因的源码解析-标准化表达水平。f，UMAP可视化的RNA速度分析所示来自a，b的Treg细胞可能发育轨迹。箭头表示速度流线。
PI3Kδ抑制可加重结肠炎
为了更详细地探索PI3Kδ抑制与胃肠道毒性之间的联系，作者使用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的急性结肠炎模型。至关重要的是，与安慰剂治疗的小鼠相比，作者发现用PI3Kδi治疗的小鼠表现出加速和恶化的疾病表型，体重迅速减轻，总体结肠炎评分更高，其特征在于显著更高的炎症，隐窝损伤和浸润面积(程度)(图3a，b)，这表明治疗介导的组织稳态改变驱动免疫病理。为了规避这些irAEs的出现，作者假设Treg细胞的短暂消耗足以限制肿瘤中的免疫抑制环境，从而发挥抗肿瘤免疫，而不会对非肿瘤器官造成实质性毒性。为此，作者设计了间歇给药方案，即比较PI3Kδi连续给药，间歇给药(PI3Kδi治疗4天，停药3天)，和不频繁给药(PI3Kδi治疗2天，停药5天)，总共两个治疗周期(图3c)。结果所有治疗条件都导抑制肿瘤生长，尽管在不频繁的给药条件下并不显著，这表明免疫抑制TME的短暂中断即可驱动抗肿瘤免疫。最重要的是，只有连续给药才导致结肠组织中CD8+T细胞浸润增加和Treg细胞水平下降(图3d)，表明间歇性给药方案也可能降低人的irAEs。
图3：PI3Kδi加重结肠炎。
图3a，在实验期间小鼠被喂食对照饮食或含有PI-的饮食，并在第14-20天另外饲喂2.5%的葡聚糖硫酸钠(DSS)。相对于治疗前第0天的体重变化。b，结肠组织切片、炎症、程度、隐窝损伤和整体结肠炎评分。c，d，不频繁给药、间歇性给药和连续给药的肿瘤体积(c)和流式细胞术分析的细胞频率(d)。